七彩神仙雌雄鱼的分辨可在同中求异的情况下区别。一般来说雄欲比雌鱼大（这是指同一窝雨而言），在有些品系中雄鱼的头会较突起，雌鱼的都会比较圆顺，在背鳍和臀鳍上，雄鱼通常会比雌鱼略大一些。色泽条纹上也常会出现差异，例如雌鱼的红色条纹可能会较多，雄鱼会较少，甚至没有条纹，这种表现也反映在红色系七彩神仙身上，正因为如此，红色系的七彩神仙雌鱼一般红的多一点，深浓一点。当然这种辨别不可能百分之百准确。

七彩神仙的雌雄分辨，最准确的方法是从生殖器上判定，雄鱼的输精管较为尖细，雌鱼的产卵管较为圆而粗，但是这些要在发情产卵期才看得清楚。平常的时候，除非经验较丰富，不然也不容易看准。结合各项特征会较为准确辨别。